當(dāng)乳酸化遇上鐵死亡，如何撰寫基金課題標(biāo)書

乳酸化和鐵死亡作為近年來生命科學(xué)領(lǐng)域的熱門研究話題，受到廣泛關(guān)注。這兩個(gè)過程在細(xì)胞生物學(xué)和疾病治療研究中扮演著重要角色，吸引了眾多科研工作者的目光。國(guó)家自然科學(xué)基金作為支持基礎(chǔ)研究的重要途徑，對(duì)推動(dòng)這一領(lǐng)域的發(fā)展起到了關(guān)鍵作用。今天，我們將以一個(gè)2023年成功獲批的相關(guān)項(xiàng)目為例，深入探討如何撰寫一份高質(zhì)量的國(guó)自然申請(qǐng)書。

題目：PKM2乳酸化修飾通過Chac1抑制M2巨噬細(xì)胞的鐵死亡減輕燒傷膿毒癥肺損傷機(jī)制研究

PKM2（丙酮酸激酶M2型）：PKM2是一種酶，參與糖酵解過程，即將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸。在許多腫瘤細(xì)胞中，PKM2促進(jìn)糖酵解過程以滿足快速增長(zhǎng)的能量需求。乳酸化修飾是一種翻譯后修飾，影響PKM2的功能。

乳酸化修飾：指的是蛋白質(zhì)在特定氨基酸殘基上加入乳酸基團(tuán)的過程，這種修飾可以影響蛋白質(zhì)的功能、定位或相互作用。

Chac1：一種蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞的鐵死亡途徑。鐵死亡是一種細(xì)胞死亡方式，與鐵離子的積累和反應(yīng)性氧種的生成有關(guān)。

M2型巨噬細(xì)胞：巨噬細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞，根據(jù)其功能和激活狀態(tài)可以分為M1型和M2型。M2型巨噬細(xì)胞通常與抗炎和組織修復(fù)功能相關(guān)。

鐵死亡：一種程序性細(xì)胞死亡，由鐵離子過度積累導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的反應(yīng)性氧種，進(jìn)而損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。

燒傷膿毒癥肺損傷：是燒傷后并發(fā)膿毒癥（一種嚴(yán)重的血液感染）時(shí)可能發(fā)生的肺部損傷，通常伴隨有炎癥和免疫反應(yīng)異常。

其思路大致為：

PKM2的乳酸化修飾通過激活Chac1，抑制M2型巨噬細(xì)胞的鐵死亡，從而減輕燒傷膿毒癥引起的肺損傷。  

該如何進(jìn)一步撰寫標(biāo)書呢？

摘要

摘要撰寫時(shí)注意其包括以下幾個(gè)部分：

（1）疾病研究的問題（提出問題）；

（2）目前研究熱點(diǎn)（問題切入）；

（3）預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（提出假設(shè)的依據(jù)）；

（4）提出假設(shè)（根據(jù)研究熱點(diǎn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，提出自己的科學(xué)假說，一句話）；

（5）擬進(jìn)行研究（研究?jī)?nèi)容的縮寫，打算怎么證明或驗(yàn)證假設(shè)）；

（6）研究意義。同時(shí)撰寫時(shí)嚴(yán)格把控字符數(shù)，400以內(nèi)

根據(jù)以上幾個(gè)要素，這里我們的摘要可以寫為：

燒傷膿毒癥引起的肺損傷是一種常見且致命的并發(fā)癥，迫切需要新型治療策略。當(dāng)前對(duì)PKM2的乳酸化修飾在燒傷膿毒癥中的作用及其機(jī)制了解有限。前期研究顯示，乳酸化修飾的PKM2能夠在細(xì)胞水平上調(diào)節(jié)代謝路徑，我們還發(fā)現(xiàn)Chac1在調(diào)控鐵死亡中起著關(guān)鍵作用�；�于此，我們提出科學(xué)假說：“PKM2的乳酸化修飾通過激活Chac1，抑制M2型巨噬細(xì)胞的鐵死亡，從而減輕燒傷膿毒癥引起的肺損傷�！北卷�(xiàng)目將在組織樣本水平、體內(nèi)、體外和分子水平，借助流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光標(biāo)記等技術(shù)，明確Chac1的功能作用，闡釋PKM2乳酸化修飾對(duì)Chac1激活的調(diào)控機(jī)制，評(píng)價(jià)該路徑在減輕燒傷膿毒癥肺損傷中的應(yīng)用潛力。這一研究不僅能深化我們對(duì)燒傷膿毒癥肺損傷發(fā)病機(jī)制的理解，還可能為開發(fā)新的治療方法提供理論基礎(chǔ)。

（一）立項(xiàng)依據(jù)

立項(xiàng)依據(jù)的撰寫主要包括幾個(gè)部分：

（1）你要研究什么？即臨床問題

（2）研究的意義是什么？

（3）目前的國(guó)內(nèi)外研究有哪些缺陷，哪些問題，從何處入手？

（4）我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)了什么，即預(yù)實(shí)驗(yàn)，為什么我來研究這個(gè)問題最合適以及為何產(chǎn)生此假說？即闡明假說形成的思路過程。

（5）凝練出本課題的關(guān)鍵科學(xué)問題，提出「研究假說」。簡(jiǎn)要說明你的研究思路。

國(guó)自然基金重在科學(xué)假說的創(chuàng)新性、合理性、明確性、邏輯性、科學(xué)性、完善性，缺一不可。但是點(diǎn)到為止，既要證明該假說的合理，又不能把所有的實(shí)驗(yàn)都做完，是一個(gè)拼圖游戲，所以這里面分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)列舉需要有個(gè)度，預(yù)實(shí)驗(yàn)達(dá)到總研究?jī)?nèi)容的30%左右為宜。

在撰寫立項(xiàng)依據(jù)時(shí)，參考文獻(xiàn)也需要注意以下幾點(diǎn)：

（1） 選擇權(quán)威和有影響力的文獻(xiàn)；

（2） 引用最新的研究成果：近3年，不可引用太老的文章，且需引用幾篇申請(qǐng)當(dāng)年發(fā)表的文獻(xiàn)；

（3）引用適量的文獻(xiàn)：在立項(xiàng)依據(jù)中，不要過度引用文獻(xiàn)，也不要過于依賴文獻(xiàn)堆砌，青年、地區(qū)30篇左右，面上40篇左右即可。

此外，一個(gè)好的小標(biāo)題能讓專家在短時(shí)間內(nèi)更直觀地明確你的內(nèi)容，所以寫好立項(xiàng)依據(jù)的小標(biāo)題能給人留下好的第一印象，非常重要。標(biāo)題的取法注意有邏輯、有層次，上下連貫，并闡明一個(gè)具體的結(jié)論而不是xxx的作用，xxx的影響之類的科普性語句

在這里，我們可以寫做：

1.1 研究意義：揭示燒傷膿毒癥肺損傷治療新靶點(diǎn)

這部分應(yīng)該討論研究的重要性和背景。解釋為什么燒傷膿毒癥引起的肺損傷是一個(gè)值得關(guān)注的問題，以及目前治療上存在的缺陷或挑戰(zhàn)。強(qiáng)調(diào)發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)的迫切需求和潛在的臨床影響。

1.2 PKM2乳酸化修飾緩解燒傷膿毒癥引起的肺損傷

詳細(xì)介紹PKM2蛋白的乳酸化修飾如何影響燒傷膿毒癥狀態(tài)下的肺組織。解釋乳酸化修飾的生化過程，以及它如何減輕肺組織的炎癥和損傷。

1.3 PKM2乳酸化修飾促進(jìn)Chac1激活

在這部分中，闡述PKM2乳酸化修飾如何導(dǎo)致Chac1蛋白的激活。詳細(xì)描述這種激活對(duì)細(xì)胞功能的具體影響，以及它在燒傷膿毒癥肺損傷中的作用機(jī)理。

1.4 Chac1激活導(dǎo)致M2型巨噬細(xì)胞鐵死亡的抑制緩解燒傷膿毒癥引起的肺損傷

詳細(xì)討論Chac1激活如何影響M2型巨噬細(xì)胞的鐵死亡過程，以及這一過程如何有助于緩解燒傷膿毒癥引起的肺損傷。討論這種機(jī)制的潛在療效和生物學(xué)意義。

1.5 本項(xiàng)目的科學(xué)假說和后續(xù)研究計(jì)劃

在這最后部分，提出基于前面數(shù)據(jù)和理論的科學(xué)假說。詳細(xì)列出研究假說、目標(biāo)和預(yù)期結(jié)果。同時(shí)，概述后續(xù)研究計(jì)劃，包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、可能采用的方法和技術(shù)，以及如何驗(yàn)證假說或進(jìn)一步探索的步驟。

（二）項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)，以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題

2.1 研究目標(biāo)

研究目標(biāo)的撰寫注意以下幾點(diǎn)

（1）目標(biāo)清晰，層次分明，只寫目標(biāo)，不用再重復(fù)研究意義、用什么方法研究，且目標(biāo)具體，可實(shí)現(xiàn)。

（2） 突出科學(xué)性。

（3）內(nèi)容詳盡，覆蓋到所有的擬解決的科學(xué)問題。

可按照明確……關(guān)系；揭示……規(guī)律；理解……作用；闡明……機(jī)制等的模板撰寫

以本項(xiàng)目為例，研究目標(biāo)可寫做：

1.明確PKM2的乳酸化修飾與Chac1激活之間的調(diào)控關(guān)系；

2.揭示Chac1對(duì)M2型巨噬細(xì)胞鐵死亡的抑制規(guī)律；

3.理解PKM2乳酸化修飾通過Chac1抑制M2型巨噬細(xì)胞鐵死亡在減輕燒傷膿毒癥引起的肺損傷中的作用機(jī)制。

2.2 研究?jī)?nèi)容

研究?jī)?nèi)容的撰寫需注意是為了達(dá)成研究目標(biāo)而要去做的研究，與研究目標(biāo)呼應(yīng)，為具體研究方案的框架，撰寫過程中可按照臨床樣本、動(dòng)物水平、細(xì)胞水平和分子機(jī)制的研究分層次撰寫，闡明做什么事達(dá)成什么目的。同時(shí)明確細(xì)胞、動(dòng)物模型的選擇和構(gòu)建

那么，該如何撰寫呢？

1.臨床研究部分

通過收集燒傷膿毒癥患者的肺組織樣本作為臨床研究對(duì)象，并選擇健康志愿者肺組織樣本作為對(duì)照組，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。研究中擬采用50例燒傷膿毒癥患者與50名健康對(duì)照，樣本將進(jìn)行免疫組化（IHC）和Western blot技術(shù)，檢測(cè)PKM2的乳酸化狀態(tài)以及Chac1的表達(dá)情況。通過定量實(shí)時(shí)PCR（qRT-PCR）和免疫熒光染色，進(jìn)一步驗(yàn)證燒傷膿毒癥患者肺組織中M2型巨噬細(xì)胞的活性和鐵死亡相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)將幫助確定PKM2的乳酸化在調(diào)控?zé)齻�膿毒癥中的功能，從而明確其作為治療靶點(diǎn)的潛力。

2.動(dòng)物研究部分

在動(dòng)物研究方面，使用C57BL/6小鼠并通過LPS誘導(dǎo)膿毒癥肺損傷，并基于CRISPR/Cas9技術(shù)特異性敲除肺組織中PKM2的乳酸化位點(diǎn)的小鼠模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四組：野生型（對(duì)照組）、敲除型（實(shí)驗(yàn)組）、野生型+燒傷膿毒癥處理、敲除型+燒傷膿毒癥處理。通過免疫組化和細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)來評(píng)估各組小鼠的肺組織損傷程度和M2型巨噬細(xì)胞的鐵死亡。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物，確定巨噬細(xì)胞亞型的變化。

3.細(xì)胞研究部分

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將采用人類單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞系（如THP-1）和肺泡巨噬細(xì)胞系（如MRC-5），并通過RNA干擾技術(shù)（RNAi）和CRISPR/Cas9技術(shù)分別敲減和敲除PKM2的乳酸化位點(diǎn)。細(xì)胞分為正常對(duì)照組、模擬感染組、敲減/敲除組及敲減/敲除+模擬感染組，以EdU增殖檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞增殖和凋亡情況。通過免疫共沉淀（Co-IP）檢測(cè)PKM2與Chac1之間的相互作用，以及通過Western blot分析蛋白的表達(dá)變化，探索PKM2乳酸化在M2型巨噬細(xì)胞中的功能性角色。

4.分子機(jī)制研究部分

通過使用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)合免疫共沉淀（Co-IP）和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，探索PKM2乳酸化與Chac1的相互作用網(wǎng)絡(luò)及其在燒傷膿毒癥相關(guān)的鐵死亡中的調(diào)控機(jī)制。此外，運(yùn)用活細(xì)胞內(nèi)成像技術(shù)，監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度的變化，以及使用質(zhì)譜技術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)代謝物的變化，從而全面理解PKM2的乳酸化如何通過激活Chac1來調(diào)節(jié)M2型巨噬細(xì)胞的鐵死亡。

2.3 擬解決的科學(xué)問題

關(guān)鍵科學(xué)問題的撰寫需要凝練出本項(xiàng)目的重點(diǎn)難點(diǎn)問題，同時(shí)與研究目標(biāo)、研究?jī)?nèi)容相呼應(yīng)，使得研究目標(biāo)就是去解決這個(gè)問題，而研究?jī)?nèi)容就是解決這個(gè)問題的方式。撰寫中在提出科學(xué)問題之后還要解釋一下為什么這是關(guān)鍵科學(xué)問題；并給出解決方案，如何去解決這個(gè)問題。

在青年、地區(qū)項(xiàng)目中，牛啟生物團(tuán)隊(duì)認(rèn)為關(guān)鍵科學(xué)問題通常寫2個(gè)即可，面上則撰寫3個(gè)為宜。

具體如何撰寫呢？

1. 明確PKM2的乳酸化修飾如何促進(jìn)Chac1激活是本項(xiàng)目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題之一。

這個(gè)問題關(guān)鍵在于理解PKM2乳酸化修飾對(duì)Chac1激活的直接作用機(jī)制，這一過程在調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞的鐵死亡中可能發(fā)揮核心作用。本項(xiàng)目擬通過免疫共沉淀和質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)，配合雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)，證實(shí)PKM2乳酸化修飾與Chac1相互作用的分子細(xì)節(jié)。

2.闡明乳酸化修飾PKM2如何影響M2型巨噬細(xì)胞的鐵代謝是本項(xiàng)目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題之二。

鐵代謝在M2型巨噬細(xì)胞的功能中起著至關(guān)重要的作用，尤其是在燒傷膿毒癥引起的肺損傷中。該問題的研究有助于深化對(duì)鐵死亡機(jī)制的理解。本項(xiàng)目擬通過鐵離子染色、流式細(xì)胞術(shù)和鐵含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)，揭示乳酸化PKM2對(duì)鐵代謝的具體影響路徑。

3.揭示PKM2乳酸化和Chac1活性對(duì)燒傷膿毒癥肺損傷治療潛力的臨床意義是本項(xiàng)目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題之三。

探索這一問題有望為燒傷膿毒癥的治療提供新的靶點(diǎn)，對(duì)于開發(fā)新型治療方法具有重要意義。本項(xiàng)目擬通過燒傷膿毒癥患者肺組織的免疫組化分析，結(jié)合動(dòng)物模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，評(píng)估PKM2乳酸化和Chac1在臨床上的相關(guān)性及其作為治療靶點(diǎn)的潛力。